血清學(xué)反應(yīng)是指：相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集現(xiàn)象。在食品微生物檢驗(yàn)中，常用血清學(xué)反應(yīng)來鑒定分離到的細(xì)菌，以zui終確認(rèn)檢測結(jié)果。

血清學(xué)-反應(yīng)的一般特點(diǎn)

1）抗原體的結(jié)合具有特異性，當(dāng)有共同抗原體存在時(shí)，會出現(xiàn)交叉反應(yīng)。

2）抗原體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，這種結(jié)合雖相當(dāng)穩(wěn)定，但是可逆的。

3）抗原體的結(jié)合是按一定比例進(jìn)行的，只有比例適當(dāng)時(shí)，才能出現(xiàn)可見反應(yīng)。

4）反應(yīng)大體分為兩個(gè)階段進(jìn)行，但其間無嚴(yán)格界限。*階段為抗原體特異性結(jié)合階段，反應(yīng)速度很快，只需幾秒至幾分鐘反應(yīng)即可完畢，但不出現(xiàn)肉眼可見現(xiàn)象。第二階段為抗原體反應(yīng)的可見階段，表現(xiàn)為凝集、沉淀、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)等。反應(yīng)速度慢，需幾分、幾十分以至更長時(shí)間。而且，在第二階段反應(yīng)中，電解質(zhì)、PH、溫度等環(huán)境因素的變化，都直接影響反應(yīng)的結(jié)果。

習(xí)慣上將經(jīng)典的反應(yīng)分三種類別：凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)。

１、凝集反應(yīng)

顆粒性抗原（細(xì)菌、紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在電解質(zhì)參與下所形成的肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱為凝集反應(yīng)（Agglutinationreaction）。其中的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。在該反應(yīng)中，因?yàn)閱挝惑w積抗體量大，做定量實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)稀釋抗體。

１）直接凝集反應(yīng)

顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接結(jié)合所出現(xiàn)的反應(yīng)，稱為直接凝集反應(yīng)（Directagglutionreaction）。

a.玻片凝集法。是一種常規(guī)的定性試驗(yàn)方法。原理是用已知抗體來檢測未知抗原。常用于鑒定菌種、血型。如將含有痢疾桿菌抗體的血清與待檢菌液各一滴，在玻片上混勻，數(shù)分種后若出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊，即陽性反應(yīng)，證明該菌是痢疾桿菌。此法快速、簡便，但不能進(jìn)行定量測定。

b.試管凝集法。是一種定量試驗(yàn)方法。多用已知抗原來檢測血清中有無相應(yīng)抗體及其含量。常用于協(xié)助診斷某些傳染病及進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。如肥達(dá)氏反應(yīng)就是診斷傷寒、付傷寒的試管凝集試驗(yàn)。因?yàn)橐獪y定抗體的含量，故將待檢查的血清用等滲鹽水倍比稀釋成不同濃度，然后加入等量抗原，37℃或56℃，2~4小時(shí)觀察，血清zui高稀釋度仍有明顯凝集現(xiàn)象的，為該抗血清的凝集效價(jià)。

２）間接凝集反應(yīng)

　　將可溶性抗原（抗體）先吸附在一種與免疫無關(guān)的，顆粒狀微球表面，然后與相應(yīng)抗體（抗原）作用，在有電解質(zhì)存在的條件下，即可發(fā)生凝集，稱為間接凝集反應(yīng)（Indirect
agglutination）。由于載體增大了可溶性抗原的反應(yīng)面積。當(dāng)載體上有少量抗原與抗體結(jié)合。就出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)，敏感性很高。

２、沉淀反應(yīng)

可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適量電解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時(shí)間，形成肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)（Precipitation）。反應(yīng)中的抗原稱為沉淀原，抗體為沉淀素。由于在單位體積內(nèi)抗原量大，為了不使抗原過剩，故應(yīng)稀釋抗原，并以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價(jià)。

１）環(huán)狀沉淀反應(yīng)：是一種定性試驗(yàn)方法，可用已知抗體檢測未知抗原。將已知抗體注入特制小試管中，然后沿管壁徐徐加入等量抗原，如抗原與抗體對應(yīng)，則在兩液界面出現(xiàn)白色的沉淀圓環(huán)。
２）絮狀沉淀反應(yīng)：將已知抗原與抗體在試管（如凹玻片）內(nèi)混勻，如抗原抗體對應(yīng)，而又二者比例適當(dāng)時(shí)，會出現(xiàn)肉眼可見的絮狀沉淀，此為陽性反應(yīng)。
３）瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：利用可溶性抗原抗體在半固體瓊脂內(nèi)擴(kuò)散，若抗原抗體對應(yīng)，且二者比例合適，在其擴(kuò)散的某一部分就會出現(xiàn)白色的沉淀線。每對抗原抗體可形成一條沉淀線。有幾對抗原抗體，就可分別形成幾條沉淀線。瓊脂擴(kuò)散可分為單向擴(kuò)散和雙向擴(kuò)散兩種類型。單向擴(kuò)散是一種定量試驗(yàn)?？捎糜诿庖叩鞍缀康臏y定。而雙向擴(kuò)散多用于定性試驗(yàn)。由于方法簡便易行，常用于測定分析和鑒定復(fù)雜的抗原成分。

３、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)

補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)（Complementfixation
reaction）是在補(bǔ)體參與下，以綿羊紅細(xì)胞和溶血素作為指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)。補(bǔ)體無特異性，能與任何一組抗原抗體復(fù)合物結(jié)合而引起反應(yīng)。如果補(bǔ)體與綿羊紅細(xì)胞、溶血素的復(fù)合物結(jié)合，就會出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，如果與細(xì)菌及相應(yīng)抗體復(fù)合物結(jié)合，就會出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象。因此，整個(gè)試驗(yàn)需要有補(bǔ)體、待檢系統(tǒng)（已知抗體或抗原、未知抗原或抗體）及指示系統(tǒng)（綿羊細(xì)胞和溶血素）五種成份參加。其試驗(yàn)原理是補(bǔ)體不單獨(dú)和抗原或抗體結(jié)合。如果出現(xiàn)溶菌，是補(bǔ)體與待檢系統(tǒng)結(jié)合的結(jié)果，說明抗原抗體是相對應(yīng)的，如果出現(xiàn)溶血，說明抗原抗體不相對應(yīng)。此反應(yīng)操作復(fù)雜，敏感性高，特異性強(qiáng)，能測出少量抗原和抗體，所以應(yīng)用范圍較廣。

-方法--血凝和血凝抑制試驗(yàn)

一些病毒或病毒的血凝素能選擇性地使某種或某幾種動物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象稱為血凝（Hemagglutination，HA）。正粘病毒和副粘病毒是zui主要的紅細(xì)胞凝集性病毒；其他病毒包括披膜病毒、細(xì)小病毒、某些腸道病毒和腺病毒等也有凝集紅細(xì)胞的作用，但常要求比較嚴(yán)格的反應(yīng)條件，例如一定的pH范圍等。各種病毒的血凝素性質(zhì)不盡相同。某些病毒可在很廣的pH條件下呈現(xiàn)血凝作用，某些病毒則只在很窄的pH范圍內(nèi)才能凝集紅細(xì)胞。某些病毒的血凝作用具有溫度依賴性，也就是只在一定溫度范圍內(nèi)才出現(xiàn)血凝現(xiàn)象；但另一些病毒卻可在4℃、室溫和37℃呈現(xiàn)同樣的血凝作用。病毒凝集的紅細(xì)胞種類，也隨病毒種類而不同，例如某些病毒主要對人和禽的紅細(xì)胞呈現(xiàn)凝集作用，另一些病毒則可凝集豚鼠或大鼠等的紅細(xì)胞。

當(dāng)病毒的懸液中先加入特異性抗體，且這種抗體的量足以封閉病毒顆?；蚱溲貢r(shí)，則紅細(xì)胞表面的受體就不能與病毒顆?；蚱溲刂苯咏佑|，這時(shí)紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象就被抑制，稱為紅細(xì)胞凝集抑制（HemagglutinationInhibition，HI），也稱為血凝抑制反應(yīng)。血凝的原理因病毒而有所不同，如痘病毒對雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集作用并非是病毒的本身，而是痘病毒的產(chǎn)物類脂蛋白的作用。而流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素與紅細(xì)胞表面的受體糖蛋白相互吸附而發(fā)生的。病毒的血凝現(xiàn)象大致可以分為可逆轉(zhuǎn)型、不可逆轉(zhuǎn)性、凝集條件嚴(yán)格型三類。
血凝和血凝抑制試驗(yàn)有常量法和微量法兩種，目前國內(nèi)外廣泛使用的都是微量法，各要素用量均為25ul，微量法省時(shí)、省料、。以下簡要介紹本次試驗(yàn)的主要內(nèi)容，詳細(xì)內(nèi)容參見各國標(biāo)。
各實(shí)驗(yàn)室所采用的HA和HI試驗(yàn)程序不同，下面的例子是應(yīng)用V型微量板進(jìn)行的試驗(yàn)，兩種方法反應(yīng)總體積都為75ul，本試驗(yàn)所用試劑為如下：
1．生理鹽水：用蒸餾水或去離子水配制成0.85％NaCl溶液，高
壓滅菌備用。
2．紅細(xì)胞懸液：采雞血液，加于倍量的紅細(xì)胞保存液-阿氏液中，置4℃普通冰箱保存，可用一個(gè)月。使用前，取紅細(xì)胞懸液1份，用5～10倍量的生理鹽水洗滌3次，直至上清無色透明。取沉淀紅細(xì)胞，加生理鹽水制備成1％紅細(xì)胞懸液。
3．病毒液：包括接種病料后收獲的雞胚羊水、尿囊液或感染小鼠的肺乳劑，經(jīng)3000轉(zhuǎn)離心沉淀15分鐘，除去較大顆粒后應(yīng)用。血凝抑制試驗(yàn)用的血凝素抗原，系用病毒接種雞胚后收獲的雞胚尿囊液和羊水，以3000轉(zhuǎn)離心20分鐘，吸取上清液，加入3倍量的滅菌生理鹽水，并加入1：10000硫柳汞防腐，保存于4℃冰箱備用。
4．特異性抗血清：用作陽性對照。一般用雞制備。取血凝效價(jià)在1：320倍以上的雞胚尿囊液，注射壯齡雞的腹腔內(nèi)，每次10毫升，共3次，每次間隔1周。zui后一次注射后2周放血，分離血清，置-20℃以下凍存。血凝抑制效價(jià)可達(dá)1：640倍以上。另一法是將尿囊液靜脈或腹腔注射壯齡公雞，每次2毫升，間隔1周，如上法注射4～5次，血凝抑制效價(jià)有時(shí)可高達(dá)1：5000倍以上。按上法給壯齡公雞靜脈或腹腔注射1次尿囊液，7天后采血，也可獲得血凝抑制效價(jià)有時(shí)可達(dá)1：160倍的抗血清。
5．8單位或4單位抗原的配制：以能引起紅細(xì)胞100％凝集的病毒zui高稀釋度作為終點(diǎn)，即1個(gè)HA單位，終點(diǎn)滴度除以8即為含8HA單位的抗原。例如，如果血凝終點(diǎn)滴度為1：256，則8個(gè)血凝單位的稀釋度應(yīng)是1:32（256除以8），此例中將1ml抗原加入31ml生理鹽水即為8HA單位抗原。取8HA單位的抗原加入等量生理鹽水即為4HA單位抗原。
血凝素效價(jià)測定：將待檢病毒液用生理鹽水作1：5稀釋，在大孔塑料滴定板或小試管中進(jìn)行倍比稀釋，直至1：2560，每孔（管）0.25毫升，zui后1孔只加生理鹽水作為對照。隨即向各孔內(nèi)加入0.25毫升的1％雞紅細(xì)胞懸液，充分混勻，于室溫放置45分鐘后判定結(jié)果。紅細(xì)胞凝集程度以＋＋＋＋、＋＋＋、＋＋、＋和－表示。zui后1孔（管）的紅細(xì)胞應(yīng)無凝集現(xiàn)象。
紅細(xì)胞呈細(xì)砂粒狀均勻鋪于孔底者為＋＋＋＋，即100％凝集；紅細(xì)胞均勻鋪于孔底，但邊緣不整而稍向孔底集中者為＋＋＋，即75％凝集；紅細(xì)胞于孔底形成一個(gè)環(huán)狀，四周有小凝集塊者為＋＋，即50％凝集；紅細(xì)胞于孔底形成圓團(tuán)，但邊緣不夠光滑，四周稍有凝集塊者為＋，即25％凝集；紅細(xì)胞于孔底形成圓團(tuán)，邊緣光滑整齊者為-，即無凝集。
血凝素效價(jià)以＋＋為終點(diǎn)，即以能夠使50％紅細(xì)胞凝集的血凝素的zui高稀釋度作為該血凝素的血凝效價(jià)。
血凝（HA）試驗(yàn)：在微量血凝板的1～12孔均加入25ul生理鹽水。用微量移液器吸取25ul抗原加入第1孔，混勻。從第1孔吸取25ul抗原液加入第2孔，混勻后吸取25ul加入第3孔，如此進(jìn)行倍比稀釋至第11孔，從第11孔吸取25ul棄之，第12孔作為生理鹽水對照。每孔再加入25ul生理鹽水。之后每孔均加入25ul1％雞紅細(xì)胞懸液，在微量振蕩器上振蕩1min，使其混合均勻；在室溫（20℃～25℃）下作用40min后觀察結(jié)果。紅細(xì)胞凝集呈薄膜狀，均勻地覆蓋孔底，強(qiáng)凝集時(shí)凝集塊皺縮呈團(tuán)狀或邊緣呈鋸齒狀，即100％的紅細(xì)胞凝集；紅細(xì)胞凝集呈薄層，但是面積較小，孔底中央有紅細(xì)胞沉積呈小圓點(diǎn)狀，即50％的紅細(xì)胞凝集；紅細(xì)胞全部沉于孔底中心呈小圓點(diǎn)狀，周圍光滑，無分散的紅細(xì)胞，即無凝集現(xiàn)象。能使紅細(xì)胞100％凝集的病毒zui高稀釋度作為該病毒的血凝價(jià)。
血凝抑制（HI）試驗(yàn)：在微量反應(yīng)板的第1～11孔各加入25ul生理鹽水，第12孔加入50ul生理鹽水。吸取25ul血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸25ul于第2孔，依次對倍釋至第10孔，從第10孔吸取25ul棄去。1孔～11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液25ul，室溫（約20℃）靜置至少30min。每孔加入25ul1％的雞紅細(xì)胞懸液混勻，輕輕混勻，靜置約40min（室溫約20℃），若環(huán)境溫度太高可置4℃條件下進(jìn)行，對照紅細(xì)胞將呈顯鈕扣狀沉于孔底。以*抑制4個(gè)HAU抗原的血清zui高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。只有陰性對照孔血清滴度不大于2㏒2，陽性對照孔血清誤差不超過1個(gè)滴度，試驗(yàn)結(jié)果才有效。HI價(jià)小于或等于3㏒2判定HI試驗(yàn)陰性；HI價(jià)等于4㏒2為可疑，需重復(fù)試驗(yàn)；HI價(jià)大于或等于5㏒2為陽性。

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